Возможно ли преодолеть старение? Сегодня и завтра клеточной терапии

Леонид Юрьевич Прохоров

Мечта человечества о вечной жизни может сбыться. В России разработана первая в мире «Общая теория омоложения организмов». Это открытие сродни полету в космос первого спутника Земли и первого космонавта Юрия Гагарина. Вы будете одними из первых, кто станет обладать этим знанием, когда прочтете эту книгу автора – геронтолога, специалиста по клеточным технологиям. В книге дается теоретическое обоснование с доказательствами осуществимости человеческого стремления жить долго и не стареть.

МЕТОДЫ ОМОЛОЖЕНИЯ КОЖИ

Для коррекции возрастных изменений кожных покровов в настоящее время используются самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма, компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Многие из этих методов направлены на стимуляцию собственных клеток кожи, в частности, фибробластов. Однако можно решить проблему и другим образом — увеличить количество фибробластов в коже с помощью их пересадки в те места, где это необходимо.

Прежде чем пересадки фибробластов стали реальностью, исследователям пришлось решать много методических вопросов, в том числе вопросы безопасности подобных процедур.

Значительный прогресс в этом направлении был достигнут, когда исследователи научились культивировать, т. е. поддерживать жизнеспособность фибробластов вне организма, или другими словами in vitro. В 1961 г. L. Hayflick и P. S. Moorhead (Hayflick, Moorhead, 1961) представили данные о том, что даже в оптимальных условиях культивирования in vitro фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ± 10). В последующих исследованиях это наблюдение было многократно воспроизведено. Последняя фаза жизни клеток в культуре была определена как клеточное старение, а сам феномен получил по имени автора название лимит Хейфлика.

После установления лимита Хейфлика в результате многочисленных исследований было выявлено, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную продолжительность жизни. Кроме того, у нормальных клеток отсутствуют онкогенные потенции. Эти требования к культурам нормальных клеток были оформлены в виде нормативных документов.

При соблюдении этих требований появилась возможность использования культивируемых вне организма фибробластов человека для производства иммунобиологических медицинских препаратов, а затем и для терапевтических целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.

В настоящее время можно выделить два основных подхода к лечению кожи с помощью препаратов, содержащих живые фибробласты. С одной стороны, широкую известность получили методики и препараты для лечения дефектов кожи раневого и ожогового характера с помощью культур аллогенных (другого организма) эмбриональных фибробластов. Альтернативой этим методикам является возможность использования аутогенных (собственных) фибробластов человека для заместительной клеточной терапии кожных покровов (Згурский, 2004).

Считается, что наилучшие результаты клеточной терапии получаются при использовании культур эмбриональных фибробластов, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с культурами от взрослых доноров. Однако, применение клеток, полученных из эмбрионов, имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же время накапливаются данные, что собственные фибробласты сохраняют свой потенциал при старении, несмотря на уменьшение их числа в стареющем организме (Терехов, 1984; Згурский, Прохоров, 2020).

Для достижения первичных результатов необходимо получить культуры фибробластов от взрослых доноров. Было установлено, что пролиферативные способности полученных фибробластов по сравнению с эмбриональными кожными фибробластами вполне достаточны, чтобы использовать их для клеточной терапии (Згурский, 2004).

Методика получения и культивирования аутогенных фибробластов кожи

Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов берут путем биопсии кожи (срез небольшого участка кожи размером примерно 0,5 см²) пациента в области предплечья или в заушной области при местной анестезии.

Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи проводят по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывают физиологическим раствором, содержащим антибиотики, помещают в стерильную чашку Петри и обрабатывают раствором, содержащим трипсин или коллагеназу (оба ферменты). Под действием раствора ткань размягчается и из нее на дно чашки выходят живые клетки (фибробласты). Затем в чашку заливают питательную ростовую среду (см. ниже) и помещают в СО₂-инкубатор (специальный плотно закрывающийся шкаф, в котором поддерживается постоянная температура 37⁰С и повышенная концентрация (5—7%) углекислого газа в воздухе (Рис. 6); обычная концентрация СО₂ в атмосфере 0,03—0,04%, при которой фибробласты расти не могут. Клетки начинают размножаться и после заполнения всей чашки фибробластами их снимают с ростовой поверхности смесью растворов Версена (раствор ЭДТА — этилен диамин тетрауксусной кислоты и неорганических солей) и трипсина. Клетки первичной культуры центрифугируют, отмывают от компонентов раствора и суспендируют в среде культивирования.

Далее клетки переносят в культуральные флаконы (Рис. 7а и 7б), содержащие питательную ростовую среду. Ростовая среда содержит набор аминокислот, глюкозу и др. питательные вещества для клеток и 10—20% эмбриональной телячьей сыворотки (плазма крови), содержащей необходимые ростовые факторы, обеспечивающие деление клеток. Сами флаконы помещают в СО₂-инкубатор. Флаконы закрывают не плотно, а так, чтобы воздух с повышенным содержанием углекислого газа из инкубатора мог поступать внутрь флаконов. Можно использовать также флаконы с вентилируемыми крышками (с встроенным стерильным фильтром) через которые предусмотрен воздухообмен с воздухом в инкубаторе. Этим способом обеспечиваются условия для роста (деления) клеток.

Все работы проводятся в строго стерильных условиях в ламинарном шкафу (Рис. 8а и 8б), в который вентилятором через стерилизующий воздушный фильтр, расположенный сзади или сверху шкафа, под небольшим давлением нагнетается стерильный (очищенный от бактерий) воздух. За счет избыточного давления внутри ламинарного шкафа внешний воздух с бактериями внутрь не проникает, поэтому культуры клеток остаются стерильными. Работа внутри шкафа осуществляется высококвалифицированным специалистом с использованием стерильной лабораторной посуды, в том числе флаконов, пипеток, чашек Петри и др. Дополнительная стерильность осуществляется за счет обжига поверхностей посуды (горлышка флаконов, рабочих частей пипеток) в пламени спиртовой или газовой горелки, которая установлена внутри ламинарного шкафа и включена постоянно в течение всего времени работы с биологическим материалом. Сам специалист находится вне шкафа, но все действия осуществляет руками в стерильных хирургических перчатках внутри ламинарного шкафа через открытую нишу, из которой постоянно выходит стерильный воздух, не позволяющий поступать внутрь нестерильному воздуху (с бактериями) извне.

Полученные от пациентов культуры клеток используют для наработки необходимого количества клеток, достаточного для процедур (6—8 пассажей или делений клеток в культуре). Далее фибробласты тестируются на отсутствие контаминации (заражения) ВИЧ, гепатитов А, В и С, микоплазмы и хламидий. Тестирование проводится при помощи ПЦР (полимеразная цепная реакция) и иммуноферментными методами. Отсутствие онкогенных потенций клеток определяют на бестимусных (без иммунитета) мышах. Далее монослойные культуры клеток снимают с поверхности флаконов смесью растворов Версена и трипсина и суспендируют (перемешивают) с применением серологических пипеток в стерильном физиологическом растворе для инъекций. Затем 2—3 раза центрифугируют и отмывают клетки от Версена и трипсина в таком же физрастворе. Готовые суспензии сохраняют при +4⁰С. Препараты клеток используют в течение 24 часов после получения суспензии.

Жизнеспособность клеток в суспензии определяют с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток, по их способности к образованию колоний.

Процедура клеточной терапии

Процедуру введения клеток пациенту проводят методом туннельных инъекций для крупных морщин или обкалыванием мелких морщин. Количество клеток в препаратах варьирует в зависимости от процедуры, объем введенного препарата составляет в среднем 1—3 мл на процедуру. Количество вводимых клеток составляет в среднем от 1 до 10 млн.

Метод введения клеток показан на рис. 9а и 9б. Клетки вводятся с помощью инсулинового шприца в дермальный (средний) слой кожи (Згурский, 2004). Игла инсулинового шприца очень тонкая, поэтому процедура вызывает минимально неприятные ощущения.

Поверхность кожи, в которую вводятся клетки, обрабатывается стерилизующими растворами перед выполнением процедур, а все манипуляции исполнитель делает строго в стерильных резиновых перчатках и в марлевой повязке, закрывающей дыхательные органы.

Результаты применения аутогенных

фибробластов

По мнению одного из ведущих специалистов в области применения аутогенных фибробластов кандидата биологических наук А. А. Згурского (Згурский, 2004) процедура имеет несколько привлекательных моментов для косметолога и, соответственно, для пациента:

— используются собственные клетки пациента;

— обычно проводится однократное взятие биопсии;

— имеется небольшой дискомфорт в процессе применения процедур для пациента;

— эффект сохраняется длительное время;

— простота применения;

— проводится небольшое число процедур, необходимое для получения эффекта;

— отсутствуют осложнения и побочные эффекты.

Аутогенные фибробласты применяют для коррекции морщин, атрофических рубцов, атрофических участков кожи, нарушений структуры кожи (Boss et. al., 2000).

В результате применения:

— замедляется старение кожи;

— улучшается цвет кожного покрова;

— разглаживаются глубокие и исчезают мелкие морщины;

— повышается упругость и эластичность соединительной ткани кожи;

— имеется значительный эффект при коррекции рубцов и носогубных складок через 7 и 12 мес.

В первые часы после введения клеток наблюдаются местные эффекты в виде гиперемии (местное увеличение притока крови) и небольшого отека, которые исчезают через 2—3 ч. после процедуры. Положительный эффект начинает проявляться через 6—8 ч. после процедуры, что выражается в увеличении тургора (упругости) и эластичности кожи, ее кровоснабжения. Отмечен положительный эффект, заключающийся в исчезновении мелких и уменьшении крупных морщин (Крихели и др., 2004). Улучшение кожи происходит в течение нескольких месяцев. Сохранение положительного эффекта прослеживается на протяжении 12 мес. Пример применения аутогенных фибробластов для лечения носогубных складок показан на рис. 10а и 10б. На рис. 11а и 11б приведен пример улучшения поверхности кожи около глаз: рис. 11а — область глаза до процедур, рис 11б — через несколько месяцев после применения терапии. Видно, что количество и глубина морщин после процедур заметно уменьшилось. На рис. 12а и 12б показан результат лечения лобных морщин.

Некоторые специалисты пришли к заключению, что лечение морщин с помощью аутологичных фибробластов является наименее трудоемким и наиболее эффективным методом коррекции морщин в клинической практике. Этот метод представляется единственным, эффективно убирающим рубцовые изменения после угревой сыпи (Рис. 13а и 13б). По данным доктора Арнольда Клейна (США) эффективность метода достигает 95%.

Основные свойства фибробластов сохраняются при культивировании их вне организма. Эти клетки:

— сохраняют диплоидный кариотип в течение жизни;

— имеют ограниченную продолжительность жизни;

— обладают свойством контактного торможения делений и требуют прикрепления к субстрату (дну культурального флакона) для пролиферации;

— у клеток отсутствует онкогенная потенция, т.е. имеется безопасность применения аутологичных фибробластов (Келлер и др., 2000),

— отсутствуют опухоли у бестимусных мышей через 2 мес. после введения 40 млн. клеток;

— имеют нормальную сократительную способность в отношении коллагена;

— сохраняют активный синтез коллагена I типа после культивирования in vitro в течение 6 пассажей.

В одной из фирм США утверждается, что ими выполнены уже тысячи подобных процедур, пролечены тысячи пациентов. С помощью подобных методик в косметологии исправляют возрастные изменения кожи лица, морщины, рубцы кожи. Применение собственных клеток оправдано тем, что отсутствует реакция отторжения, часто возникающая при использовании клеток других людей, как эмбриональных, так и тем более полученных от взрослых доноров. Кроме того, нет этических проблем, возникающих при использовании эмбриональных клеток.

Примеры применения методик показаны также на других рисунках. Так, на рис. 14а, 14б и 14в показан вид лица пациентки с носогубной складкой (морщина) до процедуры применения аутогенных фибробластов (Рис. 14а), во время клеточной терапии (Рис. 14б) и спустя 6 месяцев после (Рис. 14в). Хорошо видно, что морщина значительно уменьшилась (разгладилась) и практически исчезла. Это произошло за счет того, что введенные аутогенные фибробласты прижились и начали вырабатывать новый, молодой коллаген и эластин.

На других рисунках (Рис. 15а и 15б) можно видеть часть участка лица пациентки до процедуры введения аутогенных фибробластов (Рис. 15а) и спустя 4—6 месяцев после выполнения терапии (Рис. 15б). Стрелкой показан дефект кожи до терапии и после. Дефект — рубцовая поверхность на щеке после удаления бородавки (Watson et al., 1999).

Возможны исправления иных подобных старческих изменений кожи (Weiss et al., 2007).

КРИОХРАНИЛИЩЕ

После применения клеточной терапии часть клеток может оказаться неиспользованной. Эти клетки следует сохранить для того, чтобы повторять процедуры в отдаленном будущем.

Для сохранения собственных клеток необходимо поместить их в специальное криохранилище. Оно представляет собой дюралюминиевую или стальную емкость, выполненную по типу термоса, с двойными стенками, между которыми создается вакуум. В неё заливается жидкий азот, имеющий температуру минус 196⁰С (Рис. 16а и 16б).

Перед замораживанием клетки отмывают от ростовой среды и выдерживают в защитном растворе, который предотвращает их от повреждения при низкой температуре. Затем суспензию клеток заливают в специальные стерильные пластмассовые ампулы, закрывающиеся герметично. Эти ампулы с клетками внутри вначале подвергаются постепенному плавному охлаждению до минус 70—80⁰С, после чего погружаются в жидкий азот в криохранилище, где они сохраняются долгие годы и десятилетия. Каждой криопробирке присваивается свой индивидуальный идентификационный номер, который заносится в компьютерную базу. Этот номер строго соответствует тому человеку, у которого взяли клетки. В базе содержатся следующие данные: имя, отчество и фамилия человека, дата рождения, характеристика крови, сведения о наследственных заболеваниях, дата взятия биопсии, некоторые другие сведения.

Компьютерная база существует не только в самом компьютере, но информация также дублируется на компакт диски или на USB-флэш-накопители (флэшки), которые хранятся в специально выделенном месте. Это исключает потерю информации. Само криохранилище постоянно находится под присмотром дежурного персонала, к нему исключен доступ посторонних лиц, а все манипуляции с контейнерами производит только тщательно обученный персонал, несущий личную ответственность за сохранность клеточного материала.

В таком криохранилище фибробласты или другие клетки могут храниться неограниченное время, а при необходимости часть их можно извлечь, разморозить, размножить и применить для клеточной терапии кожи, органов или других целей в будущем.