ДНК и её человек. Краткая история ДНК-идентификации

Елена Клещенко, 2019

Книга Елены Клещенко адресована всем, кого интересует практическое применение достижений генетики в таких областях, как криминалистика, генеалогия, история. Речь о возможности идентификации человека по его генетическому материалу. Автор рассказывает о методах исследования ДНК и о тех, кто стоял у их истоков: cэре Алеке Джеффрисе, придумавшем ДНК-дактилоскопию; эксцентричном Кэри Муллисе, сумевшем размножить до заметных количеств одиночную молекулу ДНК, и других героях «научных детективов». Детективную линию продолжает рассказ о поиске преступников с помощью анализа ДНК – от Джека-потрошителя до современных маньяков и террористов. Не менее увлекательны исторические расследования: кем был Рюрик – славянином или скандинавом, много ли потомков оставил Чингисхан, приходился ли герцог Монмут сыном королю Англии. Почему специалисты уверены в точности идентификации останков Николая II и его семьи (и отчего сомневаются неспециалисты)? В заключении читатель узнает, почему нельзя изобрести биологическое оружие против определенной этнической группы, можно ли реконструировать внешность по ДНК и опасно ли выкладывать свой геном в интернет.

* * *

Приведённый ознакомительный фрагмент книги ДНК и её человек. Краткая история ДНК-идентификации предоставлен нашим книжным партнёром — компанией ЛитРес.

Купить и скачать полную версию книги в форматах FB2, ePub, MOBI, TXT, HTML, RTF и других

← Как устроена ДНК

Как читать ДНК

Фредерик Сенгер и его метод секвенирования

Конечно, все захотели читать ДНК — черпать информацию о жизни прямо из источника. Но как читать буквы, если эти буквы — молекулы?

Необходим был удобный метод определения нуклеотидной последовательности, и такие методы стали появляться. Правда, большая часть их сегодня имеет лишь историческую значимость: для нынешних биологов “плюс-минус” секвенирование или “секвенирование по Максаму — Гилберту методом химической деградации” — что-то вроде микроскопа Левенгука.

Слово “секвенирование”, собственно, и означает “определение последовательности” (от англ. sequence); говорят о секвенировании ДНК, РНК, белков. Предложенное в 1970 г. секвенирование по Максаму — Гилберту, если коротко, подразумевало расщепление ДНК в растворах, организованное таким образом, чтобы получались молекулы всех возможных длин. Но это не самый рациональный подход. ДНК — именно та молекула, которая умеет копироваться сама на себе. Если взять у клетки ферменты, которые работают с ДНК, и научиться их использовать в наших целях, можно добиться многого. Почему бы, например, вместо того чтобы нарезать ДНК столькими способами, сколько в ней букв, не нарастить на ней дочерние цепи всех возможных длин? На этой идее основано секвенирование по Сенгеру — метод, также изобретенный в 70-е гг. прошлого века и благополучно доживший до наших дней.

Английский биохимик Фредерик Сенгер (1918–2013) — один из четырех человек, получивших две Нобелевские премии, и единственный, у которого обе — по химии (1958 и 1980 гг.): за определение структуры белка инсулина и за метод секвенирования ДНК. В 1975 г. Сенгер в совместной статье с Аланом Коулсоном представил метод “плюс-минус” секвенирования^[10]. С помощью этого метода группа Сенгера почти полностью прочла геном бактериофага φX174 (5386 нуклеотидов) — по тем временам большой успех^[11]. Однако все эти достижения затмило секвенирование по Сенгеру методом терминаторов, он же метод обрыва цепи, или дидезоксиметод^[12]. Но сначала нужно объяснить, как молекулы ДНК сортируют по размеру с помощью электрофореза.

Мы помним, что ДНК — это кислота. Кислотные свойства определяются остатками фосфорной кислоты в ее составе — фосфатами. Из школьного курса известно, что анионы кислоты заряжены отрицательно: H₃PO₄ → H⁺ + H₂PO₄^—. Поэтому, если через раствор, содержащий ДНК, пропустить ток, молекулы ДНК направятся к положительно заряженному электроду. А если раствор заменить гелем — несъедобным желе, молекулярной сеткой, заполненной жидкостью? Тогда молекулы ДНК не поплывут к плюсу туманным облачком, а каждая станет продвигаться со своей скоростью — чем длиннее молекула, тем труднее ей будет просачиваться через ячейки геля. Если же сделать в геле углубления (лунки) у отрицательного электрода, поместить в них ДНК и включить ток, от минуса к плюсу протянутся дорожки, и в них будут полоски, в каждой — молекулы ДНК определенного размера. Это называется “электрофорез ДНК”, или просто форез.

Теперь можем рассказать, как работает метод Сенгера. Реакционную смесь делят на четыре части. В каждую из четырех добавляют праймер (затравку для синтеза) — короткую молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно секвенировать. Праймер связывается с этим участком, образуя с ним двойную спираль. (Исследуемую ДНК перед этим, конечно, надо “расплести”, сделать однонитевой.) Фермент ДНК-полимераза, используя анализируемую ДНК в качестве матрицы, начинает наращивать праймер, соединяя в цепочку нуклеотиды. К обычным нуклеотидам в реакционной смеси добавлены необычные. Во-первых, некоторые нуклеотиды содержат радиоактивную метку (потом объясню зачем). Во-вторых, в каждой из четырех смесей небольшое количество одного из четырех нуклеотидов модифицировано — лишено OH-группы. К такому нуклеотиду (дидезоксинуклеотиду) нельзя присоединить следующий. А количество подобрано таким образом, чтобы среди новых цепочек были оборванные на каждом аденине — в одной пробирке, тимине — в другой, гуанине — в третьей, на каждом цитозине — в четвертой. И если потом внести реакционные смеси в лунки и провести электрофорез, получатся “лесенки”. Сложно, но станет яснее, если посмотреть на рис. 5 и 6.

Автоматическое распознавание

Как это происходило на практике? О-о… Классическое секвенирование по Сенгеру — процедура, которая у старшего поколения ассоциируется с золотым веком молекулярной биологии, когда было мало простого, покупного и готового и все умели работать руками, не то что сейчас. Не удержусь и расскажу подробнее: я ее еще застала.

Итак, гель нам понадобится не агарозный, как для крупных фрагментов, сильно различающихся по размеру, а полиакриламидный и очень тонкий. Разделить молекулы ДНК, различающиеся всего на один нуклеотид, — серьезная задача. Гель готовим из акриламида (канцероген; распишитесь, студенты, что поняли, а также насчет радиоактивной метки — хоть фосфор-32 и смешной по активности изотоп, но все-таки пить его не надо). Горячую прозрачную жидкость заливаем в пространство между двумя идеально плоскими стеклами размером примерно А3 с зажатыми по краям полосками пластика — спейсерами. Стеклянная струйка сбегает вниз, гель заливается, заливается, залива… черт-черт, пузырь застрял и не всплывает! Подхватываем что-нибудь твердое, вроде ножниц, стучим по стеклу деликатно, но сильно: уходи, пузырь, уходи! Если повезло, пузырь неохотно поднимается вверх, если нет — застывает в геле, делая значительную его часть непригодной для фореза, а студент слышит у себя за спиной: “Ничего, ручки кривые, зато старательный”… Сверху заливаем чуть менее крепкий гель, в который вставляют гребенку, чтобы получились лунки. Ждем. Гель застыл. В реакционные смеси добавляем глицерина, чтобы смесь не всплывала в растворе, а сиропчиком оседала на дно лунки, а также синего и фиолетового красителя с отрицательно заряженными молекулами, чтобы видно было, достаточно ли далеко прошел форез: раствор ДНК сам по себе прозрачен, по нему не поймешь. Вносим смесь в лунки. Аккуратненько, только не мимо лунки, а то будет каша. Не путаем, что куда, запоминаем, а лучше записываем. Готово. Ставим электрофорез. На табло источника питания четырехзначное число, обозначающее вольты, кстати, распишитесь, студенты, что поняли насчет высокого напряжения.

По прошествии изрядного времени, когда мы видим, что синее и фиолетовое пятна проехали к плюсу сколько надо, снимаем гель и сушим. Он у нас слегка радиоактивный, мы не забыли? При синтезе меченые нуклеотиды включались в цепочки ДНК, поэтому все новые молекулы фонят. Мы берем гель в темную комнату и аккуратно прижимаем его к рентгеновской пленке размером с наше стекло. Зажимаем в металлическую коробку и оставляем, скажем, до завтра. Потом проявляем пленку — и вуаля: если все сделали правильно, на прозрачной пленке темнеют полосочки, выстроенные лесенкой. Это называется “радиоавтограф геля”. Каждая полоска соответствует нуклеотиду ДНК. Кстати, сама идея метить молекулы ДНК, заставляя полимеразу включать в них нуклеотиды с радиоактивными изотопами, для удобства последующих наблюдений тоже принадлежит Фредерику Сенгеру.

Вот теперь наконец-то читаем нашу ДНК! Сначала две полоски на левой дорожке, затем одна на правой, затем на второй слева — ААGТ… Одному это расшифровывать не с руки. Зовешь помощника, даешь ему в руки линейку, велишь диктовать, а сам вбиваешь в компьютер буквы ДНК — текст, который никто еще не читал, кроме вас двоих и Господа Бога, если он вникал в такие мелочи, а не предоставил все эволюции. За один раз на четырех дорожках можно прочесть несколько сотен нуклеотидов, в идеале до тысячи. (Для сравнения, “плюс-минус” секвенирование давало около 80 нуклеотидов.) Уф-ф.

Теперь, с появлением приборов-секвенаторов, взаимодействие человека и ДНК стало менее интимным и утомительным. Человек ставит реакционную смесь в прибор и идет пить кофе… то есть писать обзор литературы для статьи. Никакой романтики преодоления трудностей. (Шучу. На самом деле трудности теперь в других местах — например, там, где начинается обработка огромного количества данных.)

Принцип метода остается тем же, что и в классическом секвенировании по Сенгеру, — синтез четырех наборов нуклеотидных цепочек, кончающихся на А, на Т, на G и на С. Только электрофорез теперь происходит не в плоском геле, а в капилляре, из которого синтезированные молекулы выходят поочередно, от самых коротких к самым длинным. И метка не радиоактивная, а флуоресцентная: каждый терминаторный нуклеотид светится своим цветом, условно говоря, А — зеленым, Т — красным, С — синим, G — желтым. (Реакционных смесей уже не четыре, а одна!) Регистрирующее устройство фиксирует вспышки на выходе из капилляра и отмечает пики свечения каждого цвета. Прибор выдает график с четырьмя кривыми, где пики соответствуют нуклеотидам; последовательность нуклеотидов сохраняется в памяти компьютера.

Первые автоматические секвенаторы начала поставлять фирма Applied Biosystems (1986). Они использовали принцип, разработанный в Калифорнийском технологическом институте, в лаборатории Лероя Худа. Что интересно, в первоначальном варианте секвенирования от Applied Biosystems реакционных смесей было четыре, и флуоресцентную метку несли не дидезоксинуклеотиды, а праймеры. Это было своего рода промежуточное звено между сенгеровским методом и последующим автоматизированным — реакция идет в четырех смесях, но все продукты бегут по одной дорожке электрофореза. Эволюция техники иногда похожа на эволюцию живых существ: полезные изменения накапливаются последовательно.

Applied Biosystems (к тому моменту подразделение компании PerkinElmer) принимала непосредственное участие в создании компании Celera Genomics, основателем которой был знаменитый Крейг Вентер, человек, который многое сделал для того, чтобы чтение ДНК вышло на новый уровень — от сотен и тысяч нуклеотидов к целым геномам. Celera Genomics вскоре прославилась как главный конкурент международного проекта “Геном человека”, а Крейг Вентер, как он сам пишет в своей автобиографии, был одним из первых клиентов Applied Biosystems еще в то время, когда руководил лабораторией в Национальных институтах здравоохранения. Важную роль в его последующих успехах, да и вообще в секвенировании генома человека сыграли автоматические секвенаторы. И наоборот: поставленная грандиозная задача — 3 млрд нуклеотидов, во времена, когда и тысячи считались успехом! — способствовала автоматизации секвенирования.

В 1995 г. Институт геномных исследований Крейга Вентера (TIGR) прочитал первый полный геном бактерии Haemophilus influenzae (1,8 млн нуклеотидных пар). И заодно, “просто чтобы проверить метод”, геном Mycoplasma genitalium (0,58 млн н.п.) — той самой бактерии, на основе которой Крейг Вентер с соавторами в первом десятилетии будущего века начнет создавать синтетический геном. Секвенирование полных бактериальных геномов микробиологи восприняли как сенсацию, историческое событие, Вентеру на конференции, когда он объявил об этом, аплодировали стоя. В 1998 г. был секвенирован геном многоклеточного организма — круглого червя Caenorhabditis elegans (100 млн н.п.).

Проект “Геном человека” стартовал в 1990 г. О получении первой “черновой” последовательности руководитель международного проекта Фрэнсис Коллинз и Крейг Вентер торжественно объявили 26 июня 2000 г. в Белом доме. Окончательное завершение проекта было анонсировано в апреле 2003 г.

Кстати: многие издания писали тогда, что, мол, “расшифрован генетический код человека”. Некоторых биологов это бесило почти так же, как “ваше ДНК”. Дело в том, что по-русски кодом принято называть шифр — правило соответствия между двумя системами символов, в нашем случае — между аминокислотами белка и нуклеотидными триплетами. Генетический код, то есть соответствие аминокислот и триплетов, у человека тот же, что у всех живых организмов, и расшифрован он давно! По-английски же кодом можно назвать и шифр, и шифровку, так что аналогичный английский заголовок не кажется глупым. Впрочем, сейчас уже и в русском языке так прочно прижился “код” как текст компьютерной программы, что это значение задним числом легитимизирует и “генетический код человека”.

Стоимость проекта “Геном человека” составила $3 млрд — по доллару за букву. Сейчас цена вопроса — порядка $1000 геном (в России пока подороже), ближайшая цель конкурирующих фирм — снижение до сотен долларов.

Во всем этом Сенгер уже не принимал непосредственного участия. В 1983 г. он ушел в отставку и прожил три десятилетия, с удовольствием работая в своем саду. Младшие коллеги о нем не забывали — тот же Крейг Вентер с гордостью приводит факсимиле поздравительной записки от Сенгера по поводу расшифровки генома H. influenzae. В 1992 г. в Великобритании был создан Институт Сенгера — некоммерческий геномный исследовательский центр. Двукратный нобелиат напутствовал коллег словами: “Пусть только попробуют не добиться успеха”. Но сам он не любил публичности и даже отказался от рыцарского звания за научные заслуги. Умер Фредерик Сенгер в 2013 г. в возрасте 95 лет. Вот как он объяснял, почему так рано удалился от дел: “Я и сам не думал об отставке, пока внезапно не осознал, что через несколько лет мне будет 65 и я буду иметь право перестать работать и заняться чем-то, чего я всегда хотел и на что не имел времени. Это возможность выглядела неожиданно привлекательной, особенно потому, что наша работа достигла высшей точки с методом ДНК-секвенирования, и я в некотором роде чувствовал, что продолжать — значит двигаться к низшей точке. Решение, что я принял, было мудрым — не только потому, что я получил огромное удовольствие от своего нового образа жизни, но и потому, что старение не улучшило мою производительность в лаборатории, и я думаю, что если б я продолжил работать, то мог бы найти это разочаровывающим и чувствовал бы вину за то, что занимаю место, нужное молодым людям”^[13].

Новое поколение выбирает…

В современных научных статьях по исследованию ДНК часто можно встретить аббревиатуру NGS. Это расшифровывается как next generation sequencing, методы секвенирования нового поколения — собирательное название для новейших методов, не использующих cенгеровскую терминацию. Все они появились после двухтысячного года, все требуют довольно сложного оборудования и программного обеспечения. Для большинства из них ДНК надо сначала фрагментировать — порезать на фрагменты в несколько сотен нуклеотидов, а затем состыковывать прочтенные кусочки текста в единую последовательность. Часто NGS называют также “высокопроизводительным”, или “параллельным”, секвенированием, потому что одновременно читается множество кусочков ДНК.

Подробно про каждый метод рассказывать не будем, только общий принцип в двух словах.

Конец ознакомительного фрагмента.

← Как устроена ДНК