Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал

Андрей Брюховецкий

Монография посвящена гемопоэтической стволовой клетке (ГСК) в диагностике и комплексном лечении фатальных заболеваний. Изучена поверхность ГСК и потенциал ее использования в ранней молекулярно-биологической диагностике ряда смертельных заболеваний, а также в оценке возрастной «изношенности» тканей. Разработана инновационная технология биомедицинского клеточного продукта на основе ГСК для лечения рака и нейродегенеративных, аутоиммунных и геронтологических болезней, а также для продления жизни.

Глава 5. Фундаментальные аспекты проблемы: взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток на модели глиобластомы in vivo (соавт. д.м. н. И.С. Брюховецкий,

м.н. с. С.В. Зайцев)

Последние 10 лет наша исследовательская группа занималась серьезными фундаментальными научными исследованиями в области изучения межклеточного взаимодействия стволовых клеток (СК) и различных типов опухолевых клеток (ОК) и опухолевых СК (ОСК) не только in vitro, но и in vivo (Брюховецкий А. С., 2003—2016; Брюховецкий И. С. и др., 2010—2016; Bryukhovetskiy A.S. et al., 2013—2016; Bryukhovetskiy I.S. et al., 2010—2016). Работа была выполнена как на частные пожертвования, так и при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (соглашения №14.575.21.0038 (RFMEF157514X0038), 14.584.21.0027 (RFMEFI58417X0027)), Российского научного фонда (проект №14-15-00084), Российского фонда фундаментальных исследований (проект №19-315-90077). В соответствии с поставленной задачей исследование включало 3 этапа работ:

1) моделирование глиобластомы in vivo;

2) изучение феномена направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток в опухолевый очаг;

3) изучение закономерностей процесса межклеточного взаимодействия в опухолевом очаге.

Создание экспериментальной модели глиобластомы in vivo

Прежде чем приступить к непосредственному описанию экспериментов, считаем необходимым сделать важную ремарку по поводу дизайна работы. Абсолютное большинство работ по изучению взаимодействия и взаимовлияния нормальных стволовых и опухолевых клеток in vivo выполнены с использованием особого типа экспериментальных животных, а именно иммунодефицитных крыс и мышей. Признавая методологическую обоснованность таких исследований, не можем не подчеркнуть, что разрыв между научной значимостью и практической ценностью таких данных весьма велик. В этой связи при планировании эксперимента мы отказались от использования иммунодефицитных животных, выбрав в качестве объекта исследования половозрелых крыс породы вистар возрастом 10—12 нед., массой 200—220 г.

Использование одобрено Этическим комитетом Школы биомедицины ДВФУ (протоколы №1 и 2 от 05.03.2017). Животных содержали в условиях, соответствующих стандартам GLP и Хельсинкской декларации WMA об этических принципах лечения животных в экспериментах. Исследование проводилось в соответствии с требованиями законодательства Великобритании (U.K. Animals Scientific Procedures), Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и руководством Национального института здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных. Все исследования на животных соответствовали рекомендациям ARRIVE и рекомендациям AVMA 2013 г. по эвтаназии экспериментальных животных.

Для моделирования низкодифференцированной злокачественной опухоли головного мозга использованы клетки глиомы линии С6 (ATCC® CCL-107). Клетки использованы в эксперименте после 3-го пассажа с момента разморозки. Перед началом эксперимента все клетки протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™). Для определения фенотипа опухолевых клеток выполняли предварительную иммуноцитохимическую характеристику. Антителами к нестину окрашивались 87,6 ± 12,1% клеток, к белку p53 — 82,3 ± 9,8%. Число клеток линии С6, позитивных в отношении к белкам CD133 (3,7 ± 2,8), S100 (7,4 ± 4,3%), глиального фибриллярного кислого белка GFAP (7,2 ± 2,2%) и βIII-тубулина (9,3 ± 4,4%), было невелико (рис. 22).

Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2 мг раствора, содержащего Zoletil 100 (Virbac, Франция) + Rometar (Bioveta a.s. Czech) в соотношении 1:4. Выполняли разрез кожи головы и накладывали фрезевое отверстие, используя Ideal Micro Drill (Harvard apparatus, US); 0,2×10⁶ клеток глиомы вводили в 5 µl стерильного 0,14 M раствора NaCl со скоростью 1 µl/м, используя гамильтоновский шприц (600 Series, Hamilton, US). Имплантацию выполняли, используя стереотаксический аппарат для крыс SR-5R-HT (Narishige, Japan), ориентируясь по координатам атласа мозга крысы (Paxinos, Watson, 2007): Ар — 1; L — 3,0; V — 4,5; TBS — 2,4 мм. Верификацию опухоли выполняли на 14-й день, используя магнитно-резонансный томограф Bruker’s PharmaScan® (Massachusetts, US).

Имплантация опухолевых клеток в мозг половозрелых крыс породы вистар приводила к быстрому формированию опухолей, хорошо визуализируемых при МРТ-обследовании головного мозга, у оперированных животных спустя 7 сут. с момента имплантации (рис. 23). К 20-му дню эксперимента опухоль была хорошо заметна на препаратах головного мозга крыс. При анализе морфологических изменений обращали на себя внимание гиперемия сосудов мозга в месте расположения опухоли, набухание и отечность мозгового вещества, наличие на поверхности мозга рельефных вдавлений от костей черепа, сглаженность основных борозд и извилин.

Как правило, опухоль занимала больше половины полушария мозга, возвышалась над его конвекситальной поверхностью и была представлена на срезах мозга светло-красной или пестрой опалесцирующей тканью, контрастной цвету основных церебральных структур (рис. 24 А—В).

Рис. 22.⠀Иммуноцитохимическая характеристика клеток линии С6, использованных для экспериментального моделирования глиобластомы in vivo. Иммуногистохимическая реакция: А — на нестин, Б — p53; В — CD133; Г — tubulin-βIII; Д — S100, Е — GFAP. Ж, З — контрольное окрашивание вторичными антителами: Ж — Alexa 488; З — Alexa 633. Специфическая флуоресценция отсутствует. Ядра докрашены DAPI

При гистологическом исследовании неопластическая ткань была представлена клетками разнообразной формы с различным количеством ядер (рис. 24 А, Б).

Рис. 23.⠀Опухоль в мозге крысы, 20 сут. после введения клеток. А — макропрепарат, опухоль возвышается над поверхностью полушария; Б — фронтальный срез головного мозга, признаки сдавления опухолью мозговых структур; В — магнитно-резонансная томограмма мозга крысы, 20 сут. эксперимента, режим N2 Turbo RARE

Рис. 24.⠀Опухоль в головном мозге крыс. А, Б — 14 сут. с момента имплантации (Б — масштаб 200 мкм); В, Г — 20 сут., опухолевая ткань с новообразованными кровеносными сосудами; Д — формирование кровеносного сосуда среди клеток сателлитного очага; Е — 30 сут., ангиоцентрическая группировка опухолевых клеток и зоны некроза в опухолевой ткани. Окраска гематоксилин-эозином

К 14-му дню опухоль содержала множество микрососудов, что свидетельствовало о высокой скорости метаболических процессов. Очевидно, хорошая васкуляризация интенсифицировала метаболизм клеток глиомы, которые, формируя вихревые очертания вокруг новообразованных сосудов, вторгались в дистрофически измененную паренхиму мозга, где формировали длинные клеточные тяжи, окруженные большим количеством солитарных клеток глиомы, инфильтрирующих мозговое вещество. На некотором удалении от первичного неопластического узла клетки глиомы уплотнялись и образовывали конгломераты, из которых возникали сателлитные очаги. В центре такого очага быстро формировался питающий кровеносный сосуд, что значительно интенсифицировало процессы неопластического роста и инвазии. С появлением в кровеносном сосуде признаков эластической мембраны обнаруживалась тенденция к слиянию сателлитного очага с первичной опухолью. При этом клетки опухоли уплотнялись вокруг кровеносного сосуда, что формировало характерную картину «псевдорозеол» (5 Е).

С 28-го дня наблюдения в глубоких отделах опухолевой ткани начинались процессы гибели неопластических клеток, что указывало на принципиальную неспособность кровеносной сети обеспечить потребности быстро растущей клеточной массы опухоли. С этого времени в опухолевой ткани появлялись зоны разрежения, большая часть опухолевых клеток концентрировалась вокруг питающего кровеносного сосуда, обнаруживая характерную картину розеол или «псевдорозеол» на фоне участков некроза, занимающих основное место в морфологической картине, окруженных псевдопалисадными структурами (рис. 25).

Таким образом, имплантация 0,2 × 10⁶ клеток глиомы линии С6 данного иммунофенотипа быстро приводила к формированию опухоли, обладающей инвазивным ростом, высокими темпами пролиферации опухолевых клеток, ангиогенезом и формированием некрозов, что, наряду с неизоморфностью образующих ее клеточных элементов, позволяет считать ее аналогом МГБ человека.

Анализ миграции гемопоэтических стволовых клеток в опухолевый очаг

Для решения конкретной задачи, а именно изучения закономерностей миграции нормальных ГСК в неопластический очаг, был использован биомедицинский препарат гемопоэтических стволовых клеток, предоставленный АО Клинический госпиталь «НейроВита» (г. Москва). По данным сопроводительной документации, препарат был представлен лейкоконцентратом мононуклеарных CD45⁺-клеток красного костного мозга, рекрутированных в системный кровоток после стимуляции больных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ). Число клеток иммунофенотипа CD34⁺ в составе лейкоконцентрата варьировало от 2,5 до 4,5%. Ксенотрансплантация согласована с Этическим комитетом Школы биомедицины ДВФУ (протокол №2 от 05.03.2017).

Рис. 25.⠀Микропрепарат мозга крысы с перевитой глиомой С6. Окраска гематоксиллин-эозином, 28 сут. эксперимента. А—Г — некротические области в центре опухолевого узла (1), новообразованные кровеносные сосуды в окружении плотно сгруппированных опухолевых клеток, формирующих псевдопалисадные структуры (2), а также множество запустевших новообразованных кровеносных сосудов в центре некротических областей (3); Д — множественные неопластические клетки, инфильтрирующие ткань мозга; E — участки инвазии по типу «языков пламени»

На протяжении 1 нед. перед проведением эксперимента животным была проведена иммуносупрессивная терапия (бусульфан Sigma-Aldrich, кат. № BP403), дексаметазон (Sigma-Aldrich, кат. № D1159), циклофосфамид (Sigma-Aldrich, кат. № BP1094)). За 2 ч до введения животным ГСК были окрашены флуоресцентными трейсерами Red CMTPX Dye (C34552, Molecular Probes; спектр возбуждения / эмиссии 577/602 нм) или Vybrant® CFDA SE (V12883, Molecular Probes; спектр возбуждения / эмиссии 492/517 нм) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Эти клетки в количестве 0,5 × 10⁶ вводили в системный кровоток крыс через центральную хвостовую вену в условиях общей анестезии. Животных выводили из эксперимента на 3, 5, 8 и 15 сут. после введения клеток. Контролем служили крысы, получавшие инфузию меченных данными маркерами ГСК, но без предшествующей имплантации опухолевых клеток.

У животных экспериментальной группы появление единичных флуоресцирующих объектов в зоне расположения опухолевой ткани наблюдалось уже через 3 дня после введения клеток. В этот период местом их предпочтительной локализации является граница между опухолью и здоровой тканью мозга. Появление флуоресцирующих объектов в более глубоких зонах опухоли регистрируется в связи с проходящими здесь кровеносными сосудами (рис. 26 А, указано стрелками).

Рис. 26.⠀Распределение меченных Vybrant® CFDA SE гемопоэтических стволовых клеток в мозге животных с привитой глиобластомой на 3-е (А) и 5-е (Б—Г) сутки после введения. А — на ранних сроках клетки локализуются вдоль границы опухоли или проникают вглубь неопластической ткани по ходу кровеносных сосудов (указаны стрелками); Б — плотное скопление флуоресцирующих клеток на 5-й день после инфузии. ГСК с сохранной морфологией группируются в глубине опухоли среди ее клеток (В) или на границе с интактной тканью мозга (Г). Ядра докрашены DAPI. Масштаб 200 мкм.

На 5 сут. с момента введения ГСК число флуоресцирующих клеток в зоне расположения опухоли заметно возрастает (рис. 26 Б). В этот период они формируют плотное скопление по периферии неопластического очага (рис. 26 Г), в виде небольших группировок обнаруживаясь в глубине опухолевой ткани (рис. 26 В). Как и на более ранних сроках наблюдения, они локализуются в непосредственной близости от кровеносных сосудов. Клетки, содержащие краситель, в этот период сохраняют четкие очертания перикарионов, гранулы флуорохрома распределены равномерно по их цитоплазме, оставляя свободной от окрашивания зону ядра (рис. 26 В, Г).

В течение 8—15 сут. (рис. 27) продолжается дальнейшая инфильтрация опухолевой ткани мечеными ГСК с параллельным уменьшением их количества в краевой зоне опухоли. В этот период начинают регистрироваться признаки разрушения введенных клеток — флуоресцентный сигнал распределяется не только в цитоплазме, но и в межклеточном пространстве. На 8 сут. после инфузии ГСК суммарная площадь флуоресцирующих объектов на границе опухолевого узла (12,7 ± 9,2%) уступала таковой в паренхиме опухолевой ткани (47,6 ± 9,3%). Через 15 дней диффузный флуоресцентный сигнал регистрируется вдоль границ опухоли, которые к этому моменту имеют размытые очертания. Наибольшая интенсивность метки сохраняется в глубоких отделах опухоли, где регистрируются отдельные клеточные элементы, конгломераты клеток, а также большие зоны перицеллюлярного скопления флуоресцирующего материала. Обращает на себя внимание тот факт, что на поздних сроках наблюдения флуоресцентная метка доминирует на границе зон клеточного разряжения опухолевой ткани — зон некроза (рис. 27, отмечены звездочками).

Рис. 27.⠀Распределение меченных Vybrant® CFDA SE гемопоэтических стволовых клеток в мозге животных с привитой глиобластомой на 8-е (А—Е) и 15-е (Ж—И) сутки после введения. Клетки локализуются преимущественно в глубине опухолевой ткани вокруг зон некроза (обозначены звездочками). Флуоресцентная метка, особенно на поздних сроках наблюдения (Ж—И), распределена как в цитоплазме клеток, так и между ними. А, Г, Ж — DAPI; Б, Д, З — флуоресцентный сигнал CFDA SE; В, Е, И — объединенный сигнал. Масштаб — 500 мкм.

В головном мозге животных группы сравнения (введение ГСК без предварительного формирования опухоли) распределение введенных клеток носило иной характер. В первые 3—5 сут. после трансплантации ГСК у крыс контрольной группы обнаружены солитарные флуоресцирующие объекты, соответствующие установленному диапазону свечения CFDA SE-позитивных ГСК. Клетки локализуются внутри кровеносных сосудов, в паренхиме мозга в непосредственной близости от них и в небольшом количестве встречаются в составе сосудистых сплетений мозговых желудочков (рис. 28).

Рис. 28.⠀Распределение трансплантированных ГСК в мозге животных без опухоли. Единичные клетки визуализируются в просвете кровеносного сосуда (А, Б) и в сосудистом сплетении мозговых желудочков (В). Окраска Vibrant CFDA SE; λ = 488 нм, Ex ⁄ Em = 492 / 517 нм. Ядра окрашены DAPI. Флуоресценция трансплантированных клеток контрастна аутосвечению мозговой ткани. Масштаб 100 мкм.

На 8—15 сут. эксперимента на препаратах мозга крыс контрольной группы объекты, соответствующие форме и размеру ГСК и флуоресцирующие длине волн, соответствующих зеленому спектру (CFDA SE 492/517), не обнаруживались.

В паренхиматозных органах (легкие, печень, почки, вилочковая железа) животных контрольной и экспериментальной групп в течение 3—5 сут. после введения обнаруживаются единичные флуоресцирующие клетки, достаточно сложно дифференцируемые от интенсивной аутофлуоресценции исследуемых органов (рис. 29).

Рис. 29.⠀Ткани паренхиматозных органов крыс контрольной группы (без глиомы С6), получивших трансплантацию гаплоидентичных гемопоэтических (СD34⁺) стволовых клеток. Окраска CFDA SE, мультифотонная флуоресцентная лазерная микроскопия (λ = 488 нм). А, Б — легкие; В, Г — печень; Д, Е — почки; Ж, З — вилочковая железа. А, В, Д, Ж — ядра клеток докрашены DAPI. Масштаб 100 мкм.

Следует отметить, что в селезенке животных обеих групп в течение первых 3—5 сут. после введения наблюдается повышение содержания флуоресцирующих клеток в области красной пульпы (Рис. 30Б). В этот же период солитарные флуоресцирующие объекты обнаруживаются в красном костном мозге животных, получавших гемотрансфузию ГСК (рис. 30 В, Г).

Рис. 30.⠀Транзиторное повышение числа флуоресцирующих клеток в красной пульпе селезенки (Б) и в красном костном мозге (Г) на 3 сут. после введения ГСК, меченных CFDA SE. А — аутофлуоресценция в белой пульпе селезенки интактных животных; В — отсутствие специфического сигнала в красном косном мозге интактных животных. Обозначения: КП — красная пульпа; БП — белая пульпа. В, Г — ядра докрашены DAPI. Масштаб 100 мкм.

При изучении процесса миграции ГСК с использованием красителя Red CMTPX Dye получены идентичные данные. Однако в отличие от клеток, окрашенных CFDA SE, сохраняющих активное свечение в течение 2 нед. после активации в клетках, краситель Red CMTPX Dye сохраняет свою флуоресценцию в течение первых 3—5 дней.

Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки, трансплантированные в организм экспериментальных животных с глиомой С6, направленно мигрируют в опухоль, где первоначально (3—5 сут.) накапливаются на границе неопластического очага и на последующих этапах (8—15 сут.) проникают в ткань глиомы и сосредотачиваются в участках некроза опухоли. Закономерностью этого процесса является накопление трансплантированных ГСК непосредственно в опухолевой ткани (47,6 ± 9,3%) и зонах инвазивного роста опухоли (12,7 ± 9,2%). При введении в организм крыс без опухоли ГСК не имеют конечной цели миграции, остаются в пределах капиллярного русла мозга и мозговых желудочков, что является существенной особенностью данного процесса. Трансплантированные клетки практически не обнаруживаются в паренхиматозных органах (легкие, печень, почка, вилочковая железа), а транзиторное повышение их количества в селезенке может свидетельствовать об их разрушении в красной пульпе при введении в системный кровоток.

Взаимодействие гемопоэтических стволовых клеток с клетками глиомы С6 в опухолевом очаге

Целью данного этапа работ являлось изучение закономерностей и механизмов воздействия ГСК на течение опухолевого процесса в мозге in vivo. Поскольку в работах, описанных выше, была использована ксенотрансплантация клеток костного мозга человека в организм крыс с глиомой С6, получивших предварительную иммуносупрессивную терапию, то для изучения закономерностей взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы in vivo мы отказались от этой модели.

Одним из ведущих способов получения клеток костного мозга для использования в онкологической практике является рекрутирование гемопоэтических стволовых клеток в системный кровоток путем стимуляции гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ), с последующим сбором лейкоконцентрата мононуклеарных СD45⁺-клеток, содержащих значительное количество CD34⁺ ГСК. В этой связи план работ включал 2 принципиально значимых этапа: 1) иммобилизация аутологических ГСК в системный кровоток экспериментального животного с глиомой С6; 2) характеристика иммуногистохимических трансформаций опухолевого узла в мозге крыс с рекрутированными в системный кровоток ГСК.

Рекрутирование ГСК в системный кровоток экспериментального животного с глиомой С6

Животным вводили подкожно Г-КСФ (Filgrastim, кат. № YY0101173 Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 4 мг/день, в течение 7 дней. Иммобилизацию мононуклеарных CD45⁺-клеток проверяли путем анализа крови экспериментальных животных с помощью проточного цитометра Navios™ (Beckman Coulter, США). В исследовании использовали антитела против крысиного CD45 (ОХ-1, конъюгированный с APC / Cy7, кат. №202216, Biolegend Inc., США). Данные цитофлуориметрии обрабатывали с помощью Navios Software v. 1.2 и Kaluza™ v. 1.2 (Beckman Coulter, США).

По данным проточной цитометрии, стимуляция животных Г-КСФ сопровождалась значительным увеличением числа CD45⁺ мононуклеарных клеток в периферической крови экспериментальных животных с глиомой С6 (рис. 31), при этом количество клеток CD45⁺, экспрессирующих основной маркер ГСК — мембранный антиген, — возрастало до 30,0 ± 1,3%, что указывает на исключительно сильное иммобилизующее действие Г-КСФ. Важно, что мы не нашли коммерческих наборов для идентификации СD34⁺-клеток крысы, однако «боковая популяция» ГСК-подобных клеток идентифицирована по методу Telford (2010).

Рис. 31.⠀Результаты цитометрического анализа образцов крови экспериментальных животных с глиомой С6, получивших стимуляцию Г-КСФ. А — доля CD45⁺-клеток в общем количестве лимфоцитов. При этом красным маркером выделено количество ГСК-подобных клеток в общем числе CD45⁺ мононуклеарных клеток; Б, В — результаты цитометрического анализа популяции СD45⁺-клеток, «боковая популяция» ГСК подобных клеток идентифицирована по методу Telford (2010)

Xарактеристика иммуногистохимических трансформаций опухолевого узла в мозге крыс с рекрутированными в системный кровоток ГСК

В данном фрагменте работы методами иммуногистохимиии выявлялись особенности распределения маркеров пролиферации, стволовости, астро — и микроглии, а также некоторых сигнальных молекул в мозге животных с привитой опухолью (контрольная группа) и после иммобизизации ГСК (группа «клетки»).

Контрольная группа

Средняя продолжительность жизни контрольных животных составила 27,2 ± 5,8 дня. Средний объем опухолевого узла в головном мозге составил 202,1 ± 19 мм³. Для животных этой группы были характерны очень быстрое нарастание неврологических симптомов, снижение и полное исчезновение рефлексов на сгибание и переворачивание, появление одностороннего птоза на стороне опухоли с последующим присоединением признаков застоя на глазном дне, дискоординация между правыми и левыми лапами, появление манежных движений. По мере роста опухоли крысы становились вялыми, неохотно пили воду и отказывались от еды с последующим развитием комы и судорожных симптомов. При морфологическом исследовании тканей мозга выявлялась типичная морфологическая картина, детально описанная ранее.

При иммуногистохимическом окрашивании антителами к ядерному белку пролиферирующих клеток (PCNA) выявлялось резкое возрастание темпов пролиферации в ткани опухоли с 10-го по 20-й дни наблюдения, что, очевидно, связанно с интенсификацией процессов деления опухолевых клеток в связи с формированием неопластической кровеносной сети. Вне опухолевого очага максимальное количество PCNA-позитивных клеток было сосредоточено в прилегающих тканях, зонах лучеобразной инвазии клеток глиомы в ткань мозга и кровеносных сосудах разного калибра (рис. 32 А—Г).

С 20-го по 30-й дни исследования количество пролиферирующих клеток в опухолевой ткани уменьшалось. К этому времени в опухолевой ткани появлялись обширные зоны запустения, некроза (рис. 33 А), а PCNA-позитивные клетки начинали уплотняться, обнаруживали отчетливую тенденцию к смещению к границам опухоли, где процессы пролиферации протекали особенно интенсивно (рис. 33 Б) и сочетались с активной миграцией иммунопозитивных клеток в прилегающие ткани мозга. Отдельные пролиферирующие клетки встречались в ткани мозга на значительном удалении от очага.

Рис. 32.⠀Иммуногистохимическая реакция на антитела к PCNA. Опухолевый очаг, 20 сут. с начала эксперимента. А — центр опухоли, видны скопления многочисленных PCNA-позитивных элементов; Б — прилежащее у опухоли вещество мозга: 1 — зоны инвазии PCNA⁺-клеток в ткань мозга, в сочетании с инфильтрацией ими окружающей ткани мозга (2); В, Г — скопление клеток PCNA⁺ в стенке и по периферии кровеносных сосудов, обведено эллипсом

Рис. 33.⠀Иммуногистохимическая реакция на антитела к PCNA через 30 сут. развития опухоли. А — центральная часть опухолевого очага; Б — граница опухоли с интактной тканью мозга. Заметно значительное увеличение количества PCNA-иммунореактивных клеток (ИР) в зонах инвазии опухоли. Масштаб 200 мкм

Динамика числа PCNA-позитивных клеток на различных сроках развития опухоли в контрольной группе представлена на рис. 34.

Рис. 34.⠀Динамика числа PCNA-ИР в ткани глиомы С6 у крыс контрольной группы. По оси ординат — количество ИР-клеток в поле зрения микропрепаратов. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * указаны достоверные (p <0,05) отличия количества PCNA-ИР клеток между 20 и 30 сут. эксперимента

Максимальное скопление микроглиальных клеток регистрировалось с 10-го по 20-й дни наблюдения непосредственно в опухолевой ткани и в прилегающих участках инвазии неопластических клеток в вещество мозга. Значительные скопления небольших IBA1-позитивных клеток с телом вытянутой формы и короткими отростками были сосредоточены в паренхиме мозга на некотором расстоянии от опухоли в области гипертрофированных кровеносных сосудов. Очевидно, скопление микроглиальных клеток в неопластическом очаге с 10-го по 20-й день эксперимента вызвано их миграцией из кровеносных сосудов и окружающих тканей мозга. Число IBA1-позитивных клеток в паренхиме мозга на стороне расположения опухоли существенно превосходило их количество в тканях интактного полушария (рис. 35).

Рис. 35.⠀Распределение микроглии в мозге животных контрольной группы на 15—20 сут. развития опухоли. Иммуногистохимическая реакция на антитела к специфическому белку микроглии (макрофагов; IBA1), 15 сут. с момента начала эксперимента. А — центр; Б — ткань мозга, непосредственно прилегающая к опухоли; видны клетки активированной микроглии с телами амебоидной формы и короткими отростками (указаны стрелками); В, Г — ткань противоположного опухоли головного мозга на 15-е (В) и 20-е (Г) сутки. Видны единичные IBA1-позитивные клетки

С 20-го по 30-й дни количество микроглиальных клеток в области опухолевого узла уменьшалось. В центре опухоли микроглиоциты уплотнялись, смещаясь к периферии, за счет чего зоны разрежения чередовались с участками скопления IBA1-позитивных клеток, как правило окружающих кровеносные микрососуды. В участках перивазального скопления микроглиоциты округлой и амебоидной формы формировали плотные ряды, окружающие зоны некроза. Значительное количество микроглиоцитов было локализовано вдоль границ опухолевого очага (рис. 36 А—В).

Рис. 36.⠀Распределение IBA1-ИР клеток в мозге животных контрольной группы на 25—30 сут. развития опухоли. А — неоднородное распределение IBA1-ИР микроглиоцитов в очагах некроза и участках активного роста опухоли; Б — концентрация IBA1-ИР вокруг кровеносного сосуда (обведены в круг) и зоны запустения (обведены маркерным карандашом), окруженные псевдопалисадными структурами (3); В — граница неопластического очага в мозге крыс контрольной группы. IBA1-ИР клетки образуют плотную кайму (1) на границе неопластического очага. 30-й день эксперимента. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

При этом значительно возрастало количество клеток микроглии за пределами опухолевого очага и локализующихся в противоположной гемисфере, что, очевидно, связано с миграцией этих клеток в опухолевый очаг.

К 30 сут. микроглиальные клетки практически не обнаруживались в ткани опухолевого узла и были сосредоточены в виде плотной каймы на границе опухоли с тканью мозга (рис. 36 В). Следуя за клетками глиомы, инфильтрирующими ткань мозга, основная масса микроглии локализовалась в дистрофически измененной паренхиме, окружающей опухолевый очаг. Очевидно, подобная картина обусловлена сложными, специфическими взаимоотношениями микроглии с опухолевыми клетками, в т.ч. с ОСК, что связано с секрецией опухолевыми клетками и микроглией цитокинов, поскольку секреторная функция микроглии в данном случае имеет решающее значение. Динамика числа IBA1-позитивных клеток на различных сроках развития опухоли в контрольной группе представлена на рис. 37.

Рис. 37.⠀Динамика числа IBA1-иммунореактивных (ИР) клеток в ткани глиомы С6 у крыс контрольной группы в ходе эксперимента. По оси ординат — количество ИР клеток в поле зрения. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * указаны достоверные (p <0,05) отличия количества IBA1-ИР клеток рядом с опухолью и в тканях противоположной гемисферы, знаком *+ — различие в количестве IBA1-ИР клеток по всем точкам эксперимента между 20 и 30 сут.

На 20-е сут. эксперимента у крыс контрольной группы GFAP-позитивные звездчатые клетки концентрировались вокруг опухолевого очага, образуя контур, конгруэнтный зоне опухолевой инвазии (рис. 38 А), и практически не обнаруживались в неопластической ткани (рис. 38 Б). Подобная морфологическая картина сохранялась к 30 сут., однако группировка GFAP-позитивных астроцитов становилась более плотной и компактной (рис. 38 В, Г). GFAP-ИР клетки окружали зону инвазии и отсутствовали в опухолевой ткани. При более предметном морфологическом исследовании тканей мозга крыс контрольной группы GFAP-ИР клетки с телом звездчатой формы с активно ветвящимися отростками образовывали скопления вдоль опухолевого очага и, очевидно, контактировали друг с другом (рис. 38 Д, Е), формируя барьер, противодействующий инвазивному процессу. При этом в ткани мозга противоположного полушария были обнаружены только единичные GFAP-позитивные клетки. При анализе рис. 36 и 38 становится очевидным, что, двигаясь навстречу друг другу, микро — и макроглия стремится отграничить зону инвазии с двух сторон, что проявляется не только в виде локальных перестроек непосредственно на границе опухоли, но и в ткани мозга в целом.

Рис. 38.⠀Иммуноцитохимическая реакция на антитела к GFAP у крыс контрольной группы. А — край опухоли в мозге контрольных крыс, 20 сут.; Б — ткань опухоли в мозге контрольных животных, 20 сут.; В — опухоль в мозге крыс контрольной группы, 30 сут.; Г — край опухолевого очага в мозге крыс группы контрольной группы, 30 сут.; Д — скопление GFAP-ИР клеток рядом с опухолью, 30 сут.; Е — единичные GFAP-ИР клетки в мозге контрольных крыс в ткани мозга противоположного полушария

На 30 сут. после формирования опухоли участки перифокальной инвазии, содержащие максимальное скопление клеток микро — и макроглии (о чем будет сказано ниже) активно окрашивались антителами к нестину, CXCR4 и TGF-β1 (рис. 39). Нестин принято считать одним из ключевых маркеров нейральных стволовых и прогениторных клеток. Как было указано выше, абсолютное большинство клеток глиобластомы, использованных в эксперименте, окрашивались антителами к этому белку, что служит признаком низкой степени дифференцировки и высокой агрессивности опухолевых клеток.

Ряд авторов относит нестин к одному из маркеров ОСК злокачественных глиом. Скопление нестин-позитивных клеток в области инвазивного роста свидетельствует об их прямом участии в этом процессе. Заслуживает внимание скопление в данном участке клеток, позитивных в отношении CXCR4-антигена. Этот цитоплазматический маркер локализован на поверхности стволовых клеток всех типов и играет ведущую роль в механизмах их миграции в опухолевый очаг. Присутствие маркера CXCR4 может означать наличие в области инвазивного роста нейральных стволовых клеток, мигрировавших из герминативных зон мозга.

Рис. 39.⠀Край опухоли в мозге крыс контрольной группы, 30 сут. эксперимента. А — иммуноцитохимическая реакция на антитела к белку стволовых клеток нестину. Нестин-позитивные клетки локализуются как на краю очага глиомы (1), так в области инвазии (2) неопластических элементов в вещество мозга. Масштаб 200 мкм; Б — иммуноцитохимическая реакция на рецепторный белок CXCR4. Клетки, несущие этот рецептор, а следовательно, мигрировавшие, локализуются как в области инвазии (1 — показаны на вставке), так и на периферии неопластической ткани (2). Масштаб 100 мкм, вставка 200 мкм; В — иммуноцитохимическая реакция на TGF-β1. Скопление белка выявлено вдоль границы зоны инвазии

Вместе с тем данный маркер локализован и на поверхности раковых или опухолевых стволовых клеток глиобластомы, что может свидетельствовать как об их прямом участии в механизмах инвазии при взаимодействии с микроглией, так и о взаимодействии с мигрировавшими сюда стволовыми клетками других типов, несущих на поверхности рецептор CXCR4. Кроме того, CXCR4 является компонентом клеточной мембраны микроглиальных клеток, привлекаемых опухолью. Вероятно, микросреда, создаваемая ОСК, селективно активирует микроглию М2-фенотипа, которая содействует процессам опухолевого роста и инвазии.

Особого внимания заслуживает скопление в данной области клеток, секретирующих TGF-β1 — лиганд, который запускает процесс эпителиально-мезенхимального перехода в опухолевых клетках и способствует обретению ими локомоторного фенотипа. Опубликованы данные о том, что TGF-β может вызывать метастазы и прогрессию опухолевого процесса по аутокринному механизму. TGF-β интенсифицирует пролиферацию клеток МГБ и усиливает процессы инвазии. Описана способность этого лиганда активизировать такие каскады, как Notch и Sonic Hedgehog, в раковых клетках; кроме того, сигнальный домен TGF-β идентифицирован на поверхности ОСК глиобластомы и гемопоэтических стволовых клеток.

Анализируя данные локализации ряда маркеров в опухоли животных контрольной группы, необходимо отметить, что высокая скорость пролиферации клеток МГБ является главной составляющей неопластического процесса. К 20-му дню эксперимента скорость пролиферации клеток опухоли начинает опережать темпы ангиогенеза, что формирует гипоксическую микросреду. Роль гипоксии весьма многогранна. Гипоксия является главным фактором экспрессии генов, ответственных за биосинтез цитокинов, инициирующих процессы миграции в опухоль соматических и стволовых клеток. Главная роль в этом процессе принадлежит хемокину семейства CXC — фактору стромальных клеток (SDF-1α). Лиганд выделяется в ответ на гипоксическое повреждение тканей и активно привлекает в зону неоплазии стволовые клетки. В литературе описаны сложные секреторные ансамбли, образуемые ОСК со стволовыми и дифференцированными клетками других типов (Lourenco et al., 2015).

Например, клетки МГБ продуцируют колониестимулирующий фактор. Допустимо предположить (Revoltella et al., 2012), что синтез этого лиганда является ответом на суровые условия гипоксии, формируемые благодаря высокой скорости пролиферации клеток злокачественной глиомы. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор мобилизует стволовые клетки из депо в костном мозге (Sainathan et al., 2008), и они мигрируют в опухолевый очаг, что позволяет глиоме их рекрутировать, вовлекая в секреторные ансамбли, модерируемые ОСК, индуцировать синтез трансформирующего фактора роста β1, роль которого представляется весьма неоднозначной.

Таким образом, клетки глиомы С6 при имплантации в мозг быстро запускают пролиферативные процессы и формируют гипоксическую микросреду, индуцируют процессы направленной миграции различных типов соматических и стволовых клеток. Значительную часть привлекаемых опухолью клеток составляют микроглиоциты. Локальное скопление клеток, имеющих иммунофенотипические признаки ОСК на границах опухоли, сопровождается повышенной продукцией в этих областях TGF-β1.

Группа «клетки»

Средняя продолжительность жизни крыс группы «клетки» составила 41 ± 6,8 дня, что больше подобного показателя в контрольной группе. Средний объем опухолевого узла в мозге этих животных составил 197 ± 14,2 мм³. В отличие от контрольной группы, темп нарастания неврологических симптомов был медленным, крысы длительно сохраняли активность. На 20 сут. отмечено появление птоза на стороне опухоли, снижение рефлексов на сгибание и переворачивание, дискоординация между передними и задними конечностями. К 30—40 сут. эксперимента крысы становились вялыми и заторможенными, реагировали на прикосновение к вибрисам пронзительным визгом, при выкладывании на спину не могли перевернуться. По мере нарастания симптоматики до комы животные выводились из эксперимента.

На 10-й день наблюдения морфологическая картина не обнаруживала существенных отличий от контрольной группы. Однако к 30 сут. признаки некроза в центре опухолевого узла в группе «клетки» были выражены в существенно меньшей степени (рис. 40).

Рис. 40.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс сравниваемых групп, 30 сут. эксперимента. А — группа клетки: 1 — область некроза (выделена маркером), 2 — активно растущая опухолевая ткань; Б — опухолевая ткань в мозге крыс контрольной группы: 1 — обширные зоны некроза (выделены маркером), 2 — фрагменты сохранной опухолевой ткани. Окраска гематоксилин-эозином

Данные сравнительной оценки площади некрозов в неопластической ткани крыс контрольной группы и группы «клетки» представлены на рис. 41.

Рис. 41.⠀Суммарная площадь некрозов в опухолевой ткани из головного мозга животных сравниваемых групп. По оси абсцисс: площадь зон некроза, % от суммарной площади микропрепаратов; М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * показаны достоверные отличия (p <0,05) группы «клетки» от контроля

Помимо этого, опухолевая ткань из мозга крыс группы «клетки» содержала многочисленные инфильтраты в виде клеток округлой или овальной формы с эксцентрично расположенным несегментированным ядром. Локализация этих инфильтратов частично соответствовала зонам некроза опухолевой ткани, при этом они практически отсутствовала в участках инвазии неопластических клеток в паренхиму мозга (рис. 42). Нельзя исключить, что в составе данных образований присутствуют трансплантированные ГСК, которые мигрировали в опухолевую ткань и накапливались в участках максимальной гипоксии.

Сравнение результатов иммуногистохимической реакции на антитела к PCNA свидетельствовало о некотором усилении процессов пролиферации в области опухолевого узла к 30-му дню эксперимента по сравнению с контрольной группой (рис. 43 А, Б), что, вероятно, было связано с трансформацией мигрировавших сюда ГСК. Подобная динамика сохранялась в группе «клетки» между 30—35 сут. эксперимента (рис. 43 В).

Рис. 42.⠀Инфильтраты в зонах разряжения и некроза опухолевой ткани у крыс группы «клетки». Размер инфильтрирующих клеток (1) существенно меньше клеток (2) опухоли. Окраска гематоксилин-эозином

Рис. 43.⠀Неопластическая ткань в мозге экспериментальных животных. Иммуногистохимическая реакция на PCNA. А — контрольная группа, 30 сут.; Б — группа «клетки», 25 сут.; В — группа «клетки», 30 сут., масштаб 100 мкм; Г — группа «клетки», 30 сут., дополнительная окраска гематоксилин-эозином; Д — противоположная сторона полушария контрольных животных; Е — противоположная сторона полушария группы «клетки»

На рис. 44 представлены сравнительные данные о количестве PCNA-ИР клеток у животных контрольной и получивших трансплантацию ГСК групп.

Рис. 44.⠀Соотношение числа PCNA-ИР клеток в опухолевой ткани глиомы С6 в мозге крыс при введении ГСК. По оси ординат — количество (тыс.) ИР клеток на микропрепаратах для каждой точки. Указаны М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы; * — достоверные данные (p <0,05) в количестве PCNA-ИР между группами

Важно отметить, что усиление пролиферации наблюдалось именно в опухоли, а вне очага глиомы встречаются только единичные PCNA-ИР клетки, сосредоточенные в кровеносных сосудах или участках мозга, подвергшихся инфильтрации опухолевыми клетками. В противоположном опухоли полушарии мозга крыс контрольной группы такие клетки практически отсутствовали. В свою очередь, у крыс, получивших трансплантацию ГСК в ткани мозга на противоположные полушария, было отмечено транзиторное увеличение PCNA-ИР элементов.

Вероятно, увеличение числа PCNA-позитивных клеток в очаге обусловлено пролиферацией мигрирующих в опухоль ГСК. В пользу данного утверждения свидетельствует резкое увеличение к 30 сут. наблюдения в опухолевой ткани крыс группы «клетки» количества микроглиоцитов (рис. 45).

Рис. 45.⠀Иммуногистохимическая реакция на антитела к специфическому белку IBA1. А—Г, контрольная группа: А — центр опухоли, 30 сут.; край опухоли: Б — 10 сут., В — 20 сут., Г — 30 сут. Д—З, группа «клетки»: Д — центр опухоли, 30 сут.; край опухоли: Е — 10 сут., Ж — 20 сут., З — 30 сут. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином. Масштаб 200 мкм

Скопления IBA1-позитивных клеток выявлялись в дистрофически измененных участках мозга, непосредственно прилегающих к опухоли и максимально подверженных инвазии, и при этом практически отсутствовали в кровеносных сосудах. Количество IBA1-ИР микроглиальных клеток в паренхиме мозга на противоположном полушарии головного мозга у крыс группы «клетки» не имело достоверных различий по сравнению с контролем (рис. 46).

Рис. 46.⠀Сравнительная оценка распределения IBA1 в мозге животных. По оси абсцисс — доля площади окрашивания специфическими антителами от площади снимка, %. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * отмечены достоверные отличия (p <0,05) между площадью IBA1⁺-ткани в опухоли и участках мозга, прилегающих к ней, в группе «клетки» от группы контроля

Микроглия (макрофаги) в этой связи заслуживает особого внимания. Данный тип клеток составляет более трети всех клеток, рекрутируемых МГБ (Fonseca et al., 2015). Известно, что примитивные макрофаги заселяют мозг на ранних этапах эмбриогенеза и поддерживают популяцию путем пролиферации, стволовые клетки костного мозга в этом процессе участия не принимают. Однако продуцируемые опухолью токсины повреждают гематоэнцефалический барьер, что делает возможным рекрутирование значительного количества моноцитов и cтволовых клеток различных типов, что оставляет возможность для их трансформации в IBA1⁺-клетки. Однако биологическая роль таких трансформаций достаточно неоднозначна.

Морфология GFAP-позитивной астроцитарной глии в мозге животных, получивших трансфузию ГСК, не демонстрирует на всем сроке наблюдения принципиальных отличий от животных контрольной группы. Как и в контроле, на 20 сут. GFAP-позитивные звездчатые клетки концентрировались вокруг очага опухолевой инвазии и практически не обнаруживались в неопластической ткани. К 30 сут. группировка GFAP-позитивных астроцитов становилась более плотной, однако эти клетки также отсутствовали в опухолевой ткани. При этом у крыс двух сравниваемых групп в ткани мозга противоположного полушария были обнаружены только единичные GFAP-позитивные клетки.

При анализе влияния трансплантированных ГСК на опухолевый очаг наше внимание привлекло изменение количества висфатина и эндотелина-1 в очаге глиомы (рис. 47). Висфатин — фермент, который лимитирует скорость биосинтеза NAD, что играет важную роль в энергетическом метаболизме. В клетках глиомы потребность в NAD существенно выше, чем в нормальных клетках ЦНС, при этом степень злокачественности МГБ коррелирует с высокими концентрациями этого агента (Reddy et al., 2008). Висфатин вовлечен в процессы гомеостаза, блокирует процессы апоптоза, стимулирует выживание клеток, обеспечивает накопление висцерального жира, задействован в механизмах нейропротекции и вовлечен в нейрогенез. Данное вещество является аналогом инсулина; биологические эффекты висфатина проявляются в оптимизации процесса утилизации глюкозы, что весьма актуально в условиях ишемии. Однако спектр биологических эффектов этого лиганда намного шире.

Рис. 47.⠀Распределение висфатина в опухолевой ткани крыс контрольной группы (А) и группы «клетки» (Б). Иммуногистохимичесакя реакция на висфатин. Докраска гематоксилин-эозином

В опухолевых клетках висфатин стимулирует пролиферацию, миграцию, ангиогенез, ремоделирование ВКМ. В очаге глиомы основным источником висфатина являются опухолевые клетки. Он также способен индуцировать процессы миграции НСК, ГСК и высокодифференцированных клеток, стимулируя в очаге продукцию MCP-1 и EGF-2. В моноцитах и макрофагах висфатин стимулирует секрецию интерлейкина-6 и — 8, а также TNF-α. Соотношение площади окрашивания опухолевой ткани у крыс сравниваемых групп представлено на рис. 48.

Рис. 48.⠀Суммарная площадь окрашивания опухолевой ткани антителами к висфатину, 30 сут. По оси абсцисс — площадь окрашивания, % от суммарной площади. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы

Как следует из представленных данных, тенденция к снижению продукции висфатина является одним из биологических эффектов ГСК. Это утверждение становится очевидным на фоне уменьшения размеров опухолевого узла и увеличения выживаемости экспериментальных животных, а также обнаруженного в данном исследовании увеличении количества эндотелина-1 в опухолевом очаге (рис. 49, 50).

Рис. 49.⠀Иммуногистохимическая реакция на антитела к эндотелину-1. Неопластическая ткань мозга крысы группы «клетки», 30 сут. эксперимента. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

Будучи вазоактивным пептидом и мощным вазодилататором с противовоспалительным действием, эндотелин-1 обладает цитостатическими свойствами, конечные эффекты этого лиганда определяются его концентрацией и зависят от локального микроокружения.

Рис. 50.⠀Суммарная площадь окрашивания опухолевой ткани антителами к эндотелину-1, 30 сут. По оси ординат — площадь окрашивания, % от суммарной площади микропрепаратов. Сравниваемые данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * показаны достоверные (p <0,05) отличия сравниваемых значений в группе «клетки» от контроля

В ходе иммуногистохимической характеристики опухолевых узлов мозга крыс с глиомой С6, получивших трансплантацию ГСК, наше внимание привлекли изменения в площади окрашивания опухолевой ткани антителами к TGF-β1 у животных сравниваемых групп. Препараты опухолевой ткани мозга крыс контрольной группы активно окрашивались антителами к этому лиганду, при этом TGF-β1 был довольно равномерно распределен как в центре, так и на периферии опухоли. Данное распределение TGF-β1 в опухолевой ткани крыс, получавших трансплантацию ГСК, сохранялось до 20—30 сут. эксперимента (рис. 51).

Рис. 51.⠀Ткань опухоли из мозга крыс, 30 сут. Иммуногистохимическая реакция на антитела к TGF-β1. Препарат дополнительно окрашен гематоксилин-эозином. Масштаб 100 мкм. А—В — контрольная группа, маркер распределен в опухолевой ткани; Г—Е — группа «клетки», единичные включения TGF-β1

У крыс группы «клетки» к этому времени в неопластической ткани появляются многочисленные полости (рис. 51), что закономерно снижает площадь окрашивания микропрепаратов антителами к этому фактору. Весьма вероятно, что обнаруженная тенденция к сокращению площади окрашивания TGF-β1 может быть связана с воздействием микроглии (рис. 52) и проявляться на более поздних сроках эксперимента.

Рис. 52.⠀Сравнительное распределение иммунореактивности к TGF-β1 в опухолевой ткани крыс сравниваемых групп на 30 сут. По оси абсцисс — доля площади окрашивания специфическими антителами к общей площади снимков, %. Данные представлены в виде М ± s.e.m., n = 30 для каждой группы. Знаком * отмечены отличия (p <0,05) между площадью ткани, иммунопозитивной к TGF-β1, в центре опухоли в группе «клетки» от группы контроля

При морфологическом анализе иммуногистохимических перестроек в опухолевой ткани животных сравниваемых групп обращало на себя внимание значительное скопление на границе опухолевого очага клеток, позитивно окрашивающихся антителами к нестину (рис. 53 А) и рецепторному белку CXCR4 (рис. 53 Б). При анализе распределения нестина и CXCR4⁺-клеток в сравнении с рис. 37 и 38 следует отметить более плотную группировку клеток на границе неопластического очага. Экспрессия нестина и CXCR4 свойственна как опухолевым клеткам, так и нормальным нейральным и гемопоэтическим стволовым клеткам, что свидетельствует об их способности к миграции, а следовательно, к взаимодействию с клетками других типов.

Рис.⠀53. Край опухоли в мозге крыс группы «клетки», 30 сут. А — иммуноцитохимическая реакция на антитела к белку стволовых клеток нестину. Многочисленные нестин-позитивные клетки локализуются в области инвазии неопластических элементов в вещество мозга; Б — иммуноцитохимическая реакция на белок CXCR4. Клетки, несущие этот рецептор, а следовательно мигрировавшие, локализуются в области инвазивного роста (1

Конец ознакомительного фрагмента.