Полный курс за 3 дня. Микробиология

Аурика Луковкина, 2009

Данный учебник предназначен для студентов медицинских ВУЗов, учащихся медицинских колледжей, а также абитуриентов. В нем содержатся сведения об ультраструктуре и физиологии бактерий, рассматриваются вопросы иммунологии и вирусологии, подробно описаны строение и морфология возбудителей различных инфекций, уделено внимание основам медицинской биотехнологии и генной инженерии.

Тема 2. Морфология и ультраструктура бактерий

1. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции

Отличия бактерий от других клеток

Выделяют следующие отличия:

1) бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра;

2) в клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан — муреин;

3) в бактериальной клетке отсутствуют аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, митохондрии;

4) роль митохондрий выполняют мезосомы — инвагинации цитоплазматической мембраны;

5) в бактериальной клетке много рибосом;

6) у бактерий могут быть специальные органеллы движения — жгутики;

7) размеры бактерий колеблются от 0,3–0,5 до 5–10 мкм.

По форме клеток бактерии подразделяются на:

1) шаровидные (кокковые) формы. Кокки имеют правильную сферическую форму или форму неправильного шара в виде почки или напоминают пламя свечи. В среднем кокки в диаметре составляют 0,5–1,5 мкм. В зависимости от взаиморасположения клеток относительно друг друга кокки делятся на микрококки с отдельным изолированным расположением; диплококки — сцепленные попарно; тетракокки — сцепленные по четыре; стрептококки — сцепленные в цепочку; сарцины — сцепленные по 8, 12, 16 и т. д.; стафилококки — сцепленные беспорядочно, внешним вводом напоминая виноградную гроздь;

2) палочковидные (или цилиндрические) формы бактерий. Длина палочки составляет 1–8 мкм, а размер в поперечнике — 0,5–2 мкм. Бактерии различаются по форме и бывают правильной и неправильной, изогнутой, цилиндрической формы; по размерам — мелкие, средние и крупные, причем длина может значительно превышать диаметр поперечника; по форме концов — обрубленные, закругленные, заостренные, утолщенные. Так же как и шаровидные бактерии, палочковидные делятся и по характеру взаиморасположения и бывают расположенными поодиночке, диплобактерии и диплобациллы, сцепленные попарно, а также стрептобактерии и стрептобациллы, сцепленные в цепочку;

3) извитые формы бактерий различаются по характеру и количеству завитков. Среди них различают вибрионы в виде изогнутых палочек или неполных завитков; спириллы с одним или несколькими завитками; спирохеты, которые делятся на лептоспиры — завитки с загнутыми крючкообразными концами (S-образная форма), боррелии — 4–12 неправильных завитков, трепонемы — 14–17 равномерных мелких завитков.

Стоит отметить, что размеры бактерий, так же как и их форма (хотя и реже), могут изменяться, и это происходит под влиянием окружающей среды, в том числе питательной среды, ее рН, температуры, лекарственного препарата и т. п., а также в зависимости от возраста культуры. При этом подобные изменения не наследуются и являются лишь модификациями.

Ультраструктура бактерий изучается с помощью электронно-микроскопических исследований, дифференциального ультрацентрифугирования и цитохимических методов.

В бактериальной клетке различают:

1) обязательные органеллы:

а) нуклеоид — ядерное вещество, распыленное в цитоплазме клетки. Не имеет ядерной мембраны, ядрышек. В нем локализуется ДНК, представленная двухцепочечной спиралью. Обычно замкнута в кольцо и прикреплена к цитоплазматической мембране. Содержит около 60 млн пар оснований. Это чистая ДНК, она не содержит белков гистонов. Их защитную функцию выполняют метилированные азотистые основания. В нуклеоиде закодирована основная генетическая информация, т. е. геном клетки. Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы ДНК с меньшей молекулярной массой — плазмиды. В них также закодирована наследственная информация, но она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки;

б) цитоплазму, которая представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (75 %), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений;

в) рибосомы, которые представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц — 30 S и 50 S. Рибосомы отвечают за синтез белка. Перед началом синтеза белка происходит объединение этих субъединиц в одну — 70 S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть;

г) цитоплазматическую мембрану, которая представляет собой сложный липидобелковый комплекс, располагающийся непосредственно под клеточной стенкой и ограничивающий протопласт клетки. Этот комплекс состоит из липидов (15–30 %), белков (50–70 %), углеводов (2–5 %) и РНК. В цитоплазматической мембране локализуются пермеазы и ферменты окислительного фосфорилирования и регулируется транспорт метаболитов и ионов; происходит выделение ферментов и токсинов; мембрана принимает участие в репликации ДНК нуклеотида и его делении; участвует в синтезе компонентов клеточной стенки, а у некоторых бактерий — и в спорообразовании.

Производными цитоплазматической мембраны клетки являются мезосомы, образующиеся путем ее инвагинации в цитоплазму. Они могут быть в виде концентрических мембран, пузырьков, трубочек, в форме петли. Мезосомы связаны с нуклеоидом и участвуют в делении клетки и спорообразовании;

д) клеточную стенку, которая представляет собой биогетерополимер — плотную структуру, окружающую протопласт клетки и придающую ей постоянную форму;

2) необязательные органеллы:

а) споры;

б) капсулы;

в) ворсинки (реснички, фимбрии);

г) жгутики.

Включения являются продуктами метаболизма микроорганизмов, которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ. К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др.

2. Строение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны

Клеточная стенка — прочное, упругое ригидное образование толщиной 150–200 ангстрем, окружающее протопласт клетки и являющееся одним из основных структурных элементов бактериальной клетки.

Выполняет следующие функции:

1) защитную, осуществление фагоцитоза;

2) регуляцию осмотического давления;

3) рецепторную;

4) принимает участие в процессах питания, деления клетки;

5) антигенную (определяется продукцией эндотоксина — основного соматического антигена бактерий);

6) стабилизирует форму и размер бактерий;

7) обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой;

8) косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки.

Клеточная стенка при обычных способах окраски не видна, но если клетку поместить в гипертонический раствор (при опыте плазмолиза), то она становится видимой.

Клеточная стенка вплотную примыкает к цитоплазматической мембране у грамположительных бактерий, у грамотрицательных бактерий клеточная стенка отделена от цитоплазматической мембраны периплазматическим пространством.

Клеточная стенка имеет два слоя:

1) наружный — пластичный;

2) внутренний — ригидный, состоящий из муреина.

В зависимости от содержания муреина в клеточной стенке различают грамположительные и грамотрицательные бактерии (по отношению к окраске по Грамму).

У грамположительных бактерий муреиновый слой составляет 80 % от массы клеточной стенки. По Грамму они окрашиваются в синий цвет. У грамотрицательных бактерий муреиновый слой составляет 20 % от массы клеточной стенки, по Грамму они окрашиваются в красный цвет.

У грамположительных бактерий наружный слой клеточной стенки содержит липопротеиды, гликопротеиды, тейхоевые кислоты, у них отсутствует липополисахаридный слой. Клеточная стенка выглядит аморфной, она не структурирована. Поэтому при разрушении муреинового каркаса бактерии полностью теряют клеточную стенку (становятся протопластами), не способны к размножению.

У грамотрицательных бактерий наружный пластический слой четко выражен, содержит липопротеиды, липополисахаридный слой, состоящий из липида А (эндотоксина) и полисахарида (О-антигена). При разрушении грамотрицательных бактерий образуются сферопласты — бактерии с частично сохраненной клеточной стенкой, не способные к размножению.

В зависимости от строения клеточной стенки все бактерии делятся на 4 отдела:

1) грациликуты — бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные (различные извитые, палочковидные, кокковые формы бактерий, а также риккетсии и хламидии);

2) фирмикуты — бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные (палочковидные, кокковые формы бактерий, а также коринебактерии и микобактерии, актиномицеты);

3) тенерикуты — бактерии без ригидной клеточной стенки (микоплазмы);

4) мендозикуты — архебактерии с дефектной клеточной стенкой и особенным строением рибосом, мембран и рибосомальных РНК.

К клеточной стенке прилегает цитоплазматическая мембрана толщиной 5–7,5 нм. Она обладает избирательной проницаемостью, принимает участие в транспорте питательных веществ, выведении экзотоксинов, энергетическом обмене клетки, является осмотическим барьером, участвует в регуляции роста и деления, репликации ДНК, является стабилизатором рибосом.

Цитоплазматическая мембрана имеет трехслойную структуру и состоит из двух слоев липидов (25–40 %) со встроенными поверхностными и интегральными белками, пронизывающими структуру мембраны. В ее состав входят фосфолипиды, липопротеин, белки, небольшое количество углеводов и другие соединения. Стоит отметить, что липидный состав мембран непостоянен. Он может меняться в зависимости от условий культивирования и возраста культуры. Разные виды бактерий отличаются друг от друга по липидному составу своих мембран.

Цитоплазматическая мембрана по сути является разделительной перегородкой, через которую с помощью ферментов постоянно осуществляется активный транспорт различных веществ и ионов, являющихся жизненно необходимыми для клетки.

В клеточной мембране содержатся и высокочувствительные рецепторы, дающие возможность клетке идентифицировать сигналы, поступающие из окружающей среды, а также питательные вещества и различные антибактериальные соединения. Кроме того, на поверхности цитоплазматической мембраны находятся активные ферментные системы, которые принимают участие в синтезе белка, токсинов, ферментов, нуклеиновых кислот и других веществ, а также в окислительном фосфорилировании.

В случае избыточного роста относительно роста клеточной стенки цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты, или выпячивания, представляющие собой либо сложно закрученные структуры — мезосомы, либо менее сложно закрученные структуры — внутрицитоплазматические мембраны. Хотя роль тех и других в жизнедеятельности клетки до конца не изучена, достоверно известно, что они играют немаловажную роль в образовании клеточных стенок и делении клетки, так как обеспечивают энергией синтез клеточной стенки, а также участвуют в секреции веществ и в спорообразовании, на которые затрачивается большое количество энергии.

3. Дополнительные органеллы бактерий

Дополнительными органеллами бактерий являются жгутики, ворсинки, капсулы и споры.

Жгутики — органеллы движения. Есть у подвижных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Это особые белковые выросты, напоминающие собой тонкие спирально закрученные нити, исходящие от цитоплазматической мембраны и прикрепленные к клеточной стенке с помощью базального тела, которое состоит из целой системы дисков, соединяющих цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку. Жгутики располагаются на поверхности бактериальной клетки. Длина жгутиков составляет 3–12 мкм, а толщина — 12–20 нм. Количество и расположение жгутиков у разных бактерий неодинаковы. Например, монотрихи имеют лишь один жгутик, а лофотрихи — целый пучок, который располагается на одном полюсе клетки, амфитрихи имеют по одному жгутику на каждом конце, у перитрихов жгутики располагаются по всей поверхности.

Химический состав жгутиков определяется одним веществом — флагеллином — белком, обладающим антигенной специфичностью. Кроме того, жгутики бактерий нередко и сами имеют белковый чехол.

При окраске по Грамму жгутики не видны, поэтому о подвижности бактерий можно судить, рассматривая живые микроорганизмы, приготовленные в виде препаратов «висячая» или «раздавленная» капля, с помощью метода фазово-контрастной микроскопии, либо косвенно — по характеру роста в среде Пешкова (полужидком агаре). При этом неподвижные бактерии растут строго по уколу, а подвижные дают диффузный рост. Бактерии находятся в движении за счет вращательных движений жгутиков. Скорость движения бактерии зависит от особенностей расположения жгутиков и физико-химических свойств среды, при этом большое значение имеют ее вязкость, осмотическое давление и другие показатели. Таким образом, будет совершенно естественным, что бактерии, имеющие жгутики, расположенные термально, будут передвигаться гораздо быстрее, чем бактерии со жгутиками, расположенными по всей поверхности.

Что касается направления передвижения бактерии, то они передвигаются либо беспорядочно, либо путем направленного перемещения большинства клеток таксиса. Кроме ориентированного (таксиса) перемещения, различают хемотаксис, вызванный разницей в концентрации химических веществ в среде, а также аэротаксис, связанный с разницей в содержании кислорода, и фототаксис, при котором различие в освещенности является главным фактором направленного движения.

Ворсинки (пили, фимбрии) — более тонкие и короткие по сравнению со жгутиками полые нитевидные белковые выросты, являющиеся поверхностными придатками бактериальной клетки. Известно более 60 типов ворсинок, хотя наиболее изученными являются только два. В зависимости от типа ворсинок определяется их функция:

1) ворсинки первого типа (комон-пили) покрывают всю поверхность бактерии, которая с их помощью способна прикрепляться к клеткам макроорганизмов. Они характерны для грамположительных бактерий;

2) ворсинки второго типа (половые ворсинки, или секс-пили) участвуют в передаче генетического материала от одной клетки к другой при конъюгации бактерий, обеспечивая контакт между мужскими и женскими бактериальными клетками в процессе конъюгации. Через них идет обмен генетической информацией от донора к реципиенту. Донор — мужская клетка — обладает секс-пилями. Женская клетка — реципиент — не имеет секс-пилей. Белок секс-пили колируется генами F-плазмиды. Также эти ворсинки участвуют и в передаче и распространении лекарственной устойчивости бактерий.

Есть и еще один вид ворсинок, которые несут ответственность за питание и водно-солевой обмен в клетке.

Капсулы — поверхностные структуры большинства бактериальных клеток и представляют собой слизистое образование, которое в зависимости от толщины и строения образует микро — или макрокапсулу, прочно связанную с клеточной стенкой и имеющую четко очерченные внешние границы. Образование капсулы зависит от среды, в которой находится бактерия, она может быть утрачена клеткой с сохранением жизнеспособности. При этом капсулообразование является защитной функцией патогенной бактерии и предохраняет ее от фагоцитоза и других защитных механизмов макроорганизма.

Макрокапсулу можно выявить, используя специальные методы окраски, сочетая позитивные и негативные методы окраски. Как правило, капсула состоит из полисахаридов, реже полипептидов. Поскольку она обладает гидрофильностью, то препятствует фагоцитозу бактерии.

Микрокапсула обнаруживается только при электронной микроскопии и представляет собой утолщение верхних слоев клеточной стенки в виде слизистого образования.

Микрокапсулы характерны для вирулентных бактерий.

Среди бактерий различают:

1) истиннокапсульные бактерии (род Klebsiella) — сохраняют капсулообразование и при росте на питательных средах, а не только в макроорганизме;

2) ложнокапсульные — образуют капсулу только при попадании в макроорганизм.

Капсулы могут быть полисахаридными и белковыми. Они играют роль антигена, могут быть фактором вирулентности.

Внимательно изучая строение клетки, следует отличать слизь, покрывающую клетку, от капсулы. Слизь в отличие от макрокапсулы, как правило, не имеет четких внешних границ и представляет собой мукоидные экзополисахариды, которые участвуют в адгезии, или прилипании к субстратам. Известно, что экзополисахариды синтезируются самими бактериями путем секреции их компонентов или синтезируются при действии внеклеточных ферментов на дисахариды.

Совместными усилиями капсула и слизь играют защитную роль, предохраняя бактерию от повреждений, высыхания (этому способствуют их гидрофильные свойства) и препятствуя действию защитных факторов бактериофагов и макроорганизма.

Споры образуются внутри бактериальной клетки и представляют собой тельца округлой или овальной формы. Факторами образования спор являются обеднение питательной среды, изменение ее влажности и (или) кислотности, а также старение культуры, попадание вегетативных клеток в почву и иное, т. е. возникновение неблагоприятных условий существования для бактерий. Особенности строения и химический состав спор (низкое содержание воды, повышенное количество кальция и др.) обеспечивают им высокую устойчивость к действию физических и химических факторов, что затрудняет борьбу со спороносными патогенными бактериями, способными сохраняться во внешней среде длительное время. Спорообразование присуще грамположительным бактериям. В отличие от вегетативных форм споры более устойчивы к действию химических, термических факторов.

Чаще всего споры образуют бактерии рода Bacillus и Clostridium.

Процесс спорообразования заключается в утолщении всех оболочек клетки. Они пропитываются солями дипикалината кальция, становятся плотными, клетка теряет воду, замедляются все ее пластические процессы. При попадании споры в благоприятные условия она прорастает в вегетативную форму.

У грамотрицательных бактерий также обнаружена способность сохраняться в неблагоприятных условиях в виде некультивируемых форм. При этом нет типичного спорообразования, но в таких клетках замедленны метаболические процессы, невозможно сразу получить рост на питательной среде. Но при попадании в макроорганизм они превращаются в исходные формы.